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龍圖騰網獲悉上海歐易生物醫學科技有限公司申請的專利一種在同一肝內膽管組織樣本中同時進行外泌體、單細胞、單細胞核測序的方法獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN115992086B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-08-15發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202211484254.6，技術領域涉及：C12N5/071；該發明授權一種在同一肝內膽管組織樣本中同時進行外泌體、單細胞、單細胞核測序的方法是由佟思雨;殷昊;肖云平;范黎明;朱燕敏;王佳琦設計研發完成，并于2022-11-24向國家知識產權局提交的專利申請。

本一種在同一肝內膽管組織樣本中同時進行外泌體、單細胞、單細胞核測序的方法在說明書摘要公布了：本發明公開了一種從同一肝內膽管組織樣本出發，基于同一組織樣本同時進行外泌體、單細胞懸液和單細胞核懸液的制備方法。本發明所述的方法可以在同一份樣本中得到更多有意義的數據，挖掘到更深層次的生物學信息，從而解析出生物現象背后這個網絡最關鍵的一個動態機制。本發明創新改進地將外泌體制備、單細胞懸液制備和單細胞核懸液制備三種技術相結合，突破了現有的技術障礙，得到樣本中更全面的細胞類型的同時，又真正解析了生命現象背后這種細胞互作的網絡機制既能了解單個細胞的功能，又能了解細胞之間是如何傳遞信號的以及特定的細胞對信號會有什么響應。從而豐富了研究數據，為挖掘更深層次的生物學機理提供了基礎。

本發明授權一種在同一肝內膽管組織樣本中同時進行外泌體、單細胞、單細胞核測序的方法在權利要求書中公布了：1.在同一肝內膽管組織樣本中同時制備外泌體、單細胞懸液和單細胞核懸液的方法，其特征在于，包括如下步驟： 一樣本準備： 取人肝內膽管組織，清洗，剪碎，并將剪碎的組織塊轉移至離心管中； 二酶解： 加入培養基，加入終濃度為0.5％的膠原酶Ⅱvv溶液、0.3％的膠原酶Ⅳ溶液、0.1％的透明質酸酶vv溶液進行37℃消化酶解15min，37℃酶解結束后加入0.2％vv的胰酶溶液，混勻后室溫靜置； 三分離： 室溫靜置后得到第一上清液、第一沉降的組織沉淀，收集的第一上清液進行第一次離心分離再次得到第二上清液、第二細胞沉淀，所述的第一次離心條件為2000～3000×g、5～10min、4～6℃； 四外泌體制備： 取前述步驟三中第二上清液再次進行第二次離心處理，所述的第二次離心條件為13000×g～16000×g、5～10min、4～6℃，得到第三上清液與第三細胞沉淀；離心結束后，取上述第三上清液進行過篩處理，結束后采用Invitrogen-TotalExosomeIsolationReagentfromcellculturemedia試劑盒對濾液進行外泌體純化； 五懸液制備： 單細胞懸液的制備： 取前述步驟三中第二細胞沉淀與步驟四中第三細胞沉淀分別使用培養基重懸后，轉移到同一離心管中，進行過篩處理；過篩處理結束后進行第一次離心處理，所述第一次離心條件為500～800×g、5～10min、4～6℃，離心結束后棄上清，向細胞沉淀中加入紅細胞裂解液，吹打混勻后室溫靜置，裂紅結束后進行第二次離心處理，第二次離心條件為500～800×g、5～10min、4～6℃，離心結束后棄上清，加入磁珠去死細胞試劑對細胞沉淀進行重懸，并孵育15min后，用1×buildingbuffer潤洗LS柱，將細胞混合液過柱后，第三次離心處理，所述第三次離心條件為300～500×g、5～10min、4～6℃，離心結束后棄上清，加入預冷的培養基對細胞沉淀進行第四次離心洗滌處理，所述第四次離心條件為100～500×g，離心5～10min，離心結束后棄上清，加入預冷培養基對細胞沉淀進行重懸處理，得到單細胞懸液； 單細胞核懸液的制備： 取前述步驟三中第一沉降的組織沉淀，使用PBS進行洗滌處理、第一次離心洗滌棄上清后，所述第一次離心條件為500g～1000×g，離心5～10min，再次加入PBS洗滌，洗滌結束后加入裂解緩沖液重懸組織沉淀開始裂解處理，所述的裂解緩沖液包括以下成份，終濃度為：50mMTris-HClpH＝7.5、1mMCaCl2、5mMNaCl、0.3％～0.4％vvNP40、0.3％～0.4％vv吐溫20、0.4UμLRNaseInhibitor，整個過程置于冰上孵育，裂解結束后進行過篩處理，過篩后收集濾液，第二次離心處理后棄上清，所述第二次離心的條件為800～1000×g、4～6℃離心5～15分鐘，加入細胞核洗滌緩沖液重懸細胞核沉淀，所述細胞核洗滌緩沖液包含以下成分，終濃度為：50mMTris-HClpH＝7.5、1mMCaCl2、5mMNaCl、0.4UμLRNaseInhibitor、1％～2％vvBSA，第三次離心洗滌后棄上清，所述第三次離心條件為500～1000×g、4℃離心5～10分鐘，用含1％BSA的PBS重懸細胞核沉淀，得到單細胞核懸液。

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