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龍圖騰網獲悉南京醫科大學申請的專利一種類原腸胚干細胞系的構建方法及應用獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN117757726B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-08-15發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202211135955.9，技術領域涉及：C12N5/0735；該發明授權一種類原腸胚干細胞系的構建方法及應用是由沙家豪;袁艷;黃銘茜;陳夢琦;張浩;員格格設計研發完成，并于2022-09-19向國家知識產權局提交的專利申請。

本一種類原腸胚干細胞系的構建方法及應用在說明書摘要公布了：本發明一種類原腸胚干細胞系的構建方法及應用，本研究建立了可以穩定傳代的類原腸胚干細胞，該細胞在一定程度上保留了干細胞的潛能性，且出現原腸胚發育階段內，中，外三個胚層細胞的基因和蛋白的表達，其特征與原腸胚階段細胞的特征一致，能夠較好的復現原腸胚階段的細胞關鍵特征。采用該干細胞系能夠在小鼠體內或在體外構建出能夠模擬原腸胚發育的三維類原腸胚體模型，并能部分復現體內胚胎發育過程中內外胚層譜系的分離、前羊膜腔的形成、原條出現以及中胚層譜系特化等關鍵生物學事件，能夠較好的復現植入后原腸胚期胚胎的關鍵特征。應用本模型能夠在體外建立影響早期胚胎發育的藥物篩選平臺，為臨床用藥提供參考。

本發明授權一種類原腸胚干細胞系的構建方法及應用在權利要求書中公布了：1.一種類原腸胚干細胞系的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括以下步驟： （1）干細胞向中胚層方向誘導： （1-1）將干細胞消化為單細胞，將細胞進行重懸，得到細胞懸液1； 所述干細胞為人胚胎干細胞或人誘導多能干細胞； 所述人胚胎干細胞為已建立的人胚胎干細胞，來源于未經過體內發育的受精14天以內的胚胎； （1-2）取細胞懸液1離心后棄去上清液，加入含有ROCK抑制劑的GK15-1培養液進一步重懸細胞，得到細胞懸液2； （1-2）中所述含有ROCK抑制劑的GK15-1培養液的成分包含： 體積百分比為80~85%的基礎培養基GMEM，體積百分比為10~15%的血清替代物KOSR、體積百分比為1%的青霉素-鏈霉素雙抗、體積百分比為1%的10?mM非必需氨基酸、體積百分比為1%的200?mMGlutaMAX添加劑、體積百分比為1%的100mM丙酮酸鈉添加劑、0.1mMβ-巰基乙醇，以及25-200ngmL重組人激活素A因子、1-10μM糖原合酶激酶-3GSK-3抑制劑CHIR99021、5-20μMROCK抑制劑； （1-3）將（1-2）得到的細胞懸液2接種到提前使用基質膠進行包被的孔板中，培養； （1-4）培養第二天，去除陳舊培養基，更換為GK15-1培養液，每天換液，直至獲得類新生中胚層細胞； （1-4）中所述GK15-1培養液的成分包含： 體積百分比為80~85%的基礎培養基GMEM，體積百分比為10~15%的血清替代物KOSR、體積百分比為1%的青霉素-鏈霉素雙抗、體積百分比為1%的10?mM非必需氨基酸、體積百分比為1%的200?mMGlutaMAX添加劑、體積百分比為1%的100mM丙酮酸鈉添加劑、0.1mMβ-巰基乙醇，以及25-200ngmL重組人激活素A因子、1-10μM糖原合酶激酶-3GSK-3抑制劑CHIR99021； （2）類新生中胚層細胞向類原始生殖細胞方向誘導： （2-1）在（1-4）得到的類新生中胚層細胞長至60-90%匯合度時將細胞消化為單細胞，將細胞進行重懸，得到細胞懸液3； （2-2）中所述含有ROCK抑制劑的GK15-2培養液的成分包含： 體積百分比為80~85%的基礎培養基GMEM，體積百分比為10~15%的血清替代物KOSR、體積百分比為1%的的青霉素-鏈霉素雙抗、體積百分比為1%的10?mM非必需氨基酸、體積百分比為1%的200?mMGlutaMAX添加劑、體積百分比為1%的100mM丙酮酸鈉添加劑、0.1mMβ-巰基乙醇、100-500ngmL重組人骨形態發生蛋白4、50-200ngmL重組人干細胞因子、1000-5000UmL重組人白血病抑制因子、50-250ngmL重組人表皮生長因子、5-20μMROCK抑制劑； （2-2）取細胞懸液3離心棄上清后，加入含有ROCK抑制劑的GK15-2培養液進一步重懸細胞，得到細胞懸液4； （2-3）將（2-2）得到的細胞懸液4接種到低粘性孔板中聚球培養；培養第二天開始，去除陳舊培養基，更換為GK15-2培養液，每天換液，直至培養獲得含有類原始生殖細胞的細胞球； （3）細胞純化： （3-1）將（2-3）得到的細胞球消化為單細胞，使用GK15-2培養液重懸細胞，得到細胞懸液5； （2-3）和（3-1）中所述GK15-2培養液的成分包含： 體積百分比為80~85%的基礎培養基GMEM，體積百分比為10~15%的血清替代物KOSR、體積百分比為1%的青霉素-鏈霉素雙抗、體積百分比為1%的10?mM非必需氨基酸、體積百分比為1%的200?mMGlutaMAX添加劑、體積百分比為1%的100mM丙酮酸鈉添加劑、0.1mMβ-巰基乙醇、100-500ngmL重組人骨形態發生蛋白4、50-200ngmL重組人干細胞因子、1000-5000UmL重組人白血病抑制因子、50-250ngmL重組人表皮生長因子； （3-2）分選（3-1）得到的細胞懸液5中CD326和CD49f雙陽性細胞；加入含有ROCK抑制劑的GK10培養液重懸細胞，得到的細胞懸液6； （3-2）中所述含有ROCK抑制劑的GK10培養液的成分包含：體積百分比為80-85%的基礎培養基GMEM，體積百分比為10%的血清替代物KOSR、體積百分比為2.5%的胎牛血清FBS、體積百分比為1%的青霉素-鏈霉素雙抗、體積百分比為1%的10?mM非必需氨基酸、體積百分比為1%的200?mMGlutaMAX添加劑、體積百分比為1%的100mM丙酮酸鈉添加劑、0.1mMβ-巰基乙醇、10μM毛喉素、10μM咯利普蘭、50-200ngmL重組人干細胞因子、5-20μMROCK抑制劑； （4）細胞擴增： 將（3-2）得到的細胞懸液6接種到提前鋪制了絲裂霉素C處理的MEFs作為飼養層細胞的孔板中；培養，24小時后換新鮮GK10培養液，獲得所述類原腸胚干細胞系； （4）中所述GK10培養液的成分包含： 體積百分比為80-85%的基礎培養基GMEM，體積百分比為10%的血清替代物KOSR、體積百分比為2.5%的胎牛血清FBS、體積百分比為1%的青霉素-鏈霉素雙抗、體積百分比為1%的10mM非必需氨基酸、體積百分比為1%的200?mMGlutaMAX添加劑、體積百分比為1%的100mM丙酮酸鈉添加劑、0.1mMβ-巰基乙醇、10μM毛喉素、10μM咯利普蘭、50-200ngmL重組人干細胞因子。

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